Proteína que comprende una proteína uricasa recombinante de una especie de mamífero que ha sido modificada para insertar uno o más residuos de lisina,

en la que dicha proteína recombinante es una proteína quimérica de dos o más secuencias de aminoácidos de proteínas de mamífero

Urato oxidasa.

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional Estadounidense Nº 601095,489, presentada el 6 de agosto de 1998.

La invención descrita en la presente memoria se realizó con el apoyo del Gobierno de Estados Unidos bajo Otorgamiento Nº DK48529, concedido por los Institutos Nacionales de Salud. El Gobierno posee ciertos derechos en la invención.

La presente invención se refiere, en general, a proteínas urato oxidasa (uricasa) y moléculas de ácido nucleico que codifican las mismas. En particular, la invención se refiere a proteínas uricasa que son particularmente útiles como, por ejemplo, intermediarios para fabricar proteínas uricasa modificadas mejoradas con inmunogenicidad reducida y biodisponibilidad incrementada, Las proteínas uricasa modificadas preferibles de la presente invención incluyen las proteínas uricasa unidas covalentemente a poli(etilenglicoles) o poli(óxidos de etileno). La presente solicitud describe, por ello, proteínas uricasa, anticuerpos que específicamente se unen con las proteínas, moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas uricasa y fragmentos útiles de las mismas, vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico, células huésped que contienen los vectores y métodos para utilizar y fabricar las proteínas uricasa y moléculas de ácido nucleico.

Antecedentes

La gota es la enfermedad inflamatoria articular más común en los hombres de más de 40 años (Roubenoff 1990). La artritis gotosa dolorosa se produce cuando el nivel sanguíneo elevado de ácido úrico (hiperuricemia) lleva a la formación episódica de cristales microscópicos de urato monosódico monohidrato en las articulaciones. Con el tiempo, la hiperuricemia crónica también puede dar como resultado depósitos de urato cristalino destructivos (tofos) alrededor de las articulaciones, en los tejidos blandos, y en algunos órganos (Hershfield 1996). El ácido úrico tiene solubilidad limitada en la orina y cuando es sobreexcretado (hiperuricosuria) puede causar cálculos renales (uricolitiasis). En pacientes con ciertos cánceres, particularmente leucemia y linfoma, la marcada hiperuricemia e hiperuricosuria (debido al aumento en el recambio y lisis de las células tumorales durante la quimioterapia) representan un riesgo serio de falla renal obstructiva, aguda (Sandberg et al. 1956; Gold y Fritz 1957; Cohen et al. 1980; Jones et al. 1990). La hiperuricemia grave y la gota están asociadas a la disfunción renal a partir de diversas causas, que incluyen terapia con ciclosporina para evitar el rechazo de aloinjerto de órgano (West et al. 1987; Venkataseshan et al. 1990; Ahn et al. 1992; Delaney et al. 1992; George y Mandell 1995).

La hiperuricemia puede resultar de la sobreproducción y excreción insuficiente de urato (Hershfield y Seegmiller 1976; Kelley et al.1989; Becker y Roessler 1995). Cuando es leve, la hiperuricemia puede controlarse con dieta, pero cuando es pronunciada y se asocia a consecuencias clínicas serias, requiere tratamiento con fármacos, un agente uricosúrico que promueve la excreción de ácido úrico (ineficaz si la función renal está reducida), o el inhibidor de la oxidasa xantina alopurinol, que bloquea la formación de urato. El alopurinol es el soporte principal de la terapia en pacientes con gota tofácea, insuficiencia renal, leucemia, y algunos trastornos heredados. El tratamiento para la hiperuricemia es generalmente eficaz y bien tolerado. Sin embargo, algunos pacientes con gota tofácea incapacitante, desfigurante son refractarios a toda terapia convencional (Becker 1988; Fam 1990; Rosenthal y Ryan 1995). Además, ∼2% de los pacientes tratados con alopurinol desarrollan reacciones alérgicas, y un grave síndrome de hipersensibilidad se produce en ∼0,4% (Singer y Wallace 1986; Arellano y Sacristan 1993). Este síndrome a menudo amenazante para la vida puede causar falla hepática y renal aguda, y grave lesión de la piel (necrólisis epidérmica tóxica, dermatitis exfoliativa, eritema multiforme, síndrome de Stevens-Johnson). El alopurinol también interfiere con el metabolismo de azatioprina y 6-mercaptopurina, fármacos utilizados en el tratamiento de leucemia y para la prevención del rechazo de aloinjerto de órganos, afecciones en las que se produce hiperuricemia marcada y puede causar gota grave o amenazar la función renal.

Finalmente, la hiperuricemia es el resultado de la inactivación mutacional del gen humano para la urato oxidasa (uricasa) durante la evolución (Wu et al. 1989; Wu et al. 1992). La uricasa activa en los peroxisomas del hígado de la mayor parte de los primates no humanos y otros mamíferos convierten el urato en alantoína (+ CO₂ y H₂O₂), que es 80-100 veces más soluble que el ácido úrico y es manipulada más eficientemente por el riñón. Se ha utilizado la uricasa parenteral, preparada a partir de Aspergillus flavus (Uricozyme®, Clin-Midy, París), para tratar hiperuricemia grave asociada a la quimioterapia de leucemia durante 20 años en Francia e Italia (London y Hudson 1957; Kissel et al. 1968; Brogard et al. 1972; Kissel et al. 1972; Potaux et al. 1975; Zittoun et al. 1976; Brogard et al. 1978; Masera et al. 1982), y se ha utilizado en recientes ensayos clínicos en pacientes con leucemia en Estados Unidos (Pui et al. 1997). La uricasa posee una aparición de acción más rápida que el alopurinol (Masera et al. 1982; Pui et al. 1997). En pacientes con gota, las infusiones con uricasa pueden interrumpir los ataques agudos y disminuir el tamaño de los tofos (Kissel et al. 1968; Potaux et al. 1975; Brogard et al. 1978).

Aunque es efectiva para tratar la hiperuricemia aguda durante un corto transcurso de quimioterapia, la infusión diaria de uricasa de A. flavus sería una grave desventaja para tratar la gota tofácea o recurrente. Además, la eficacia de la uricasa de A. flavus disminuye rápidamente en pacientes que desarrollan anticuerpos anti-uricasa (Kissel et al. 1968; Brogard et al. 1978; Escudier et al. 1984; Mourad et al. 1984; Sibony et al. 1984). Se han producido reacciones alérgicas graves, que incluyen anafilaxis (Donadio et al. 1981; Montagnac y Schillinger 1990; Pui et al. 1997). Claramente se necesita una preparación de uricasa de acción más prolongada, menos inmunogénica para la terapia crónica.

Una metodología para secuestrar las enzimas exógenas de las proteasas y el sistema inmune incluye el acoplamiento covalente del polímero no tóxico, inerte, monometoxipolietilenglicol (PEG) a la superficie de las proteínas (Harris y Zalipsky 1997). Primero se demostró que el uso de PEGs con Mr ∼1.000 a >10.000 prolonga la vida en circulación y reduce la inmunogenicidad de diversas proteínas extrañas en animales (Abuchowski et al. 1977a; Abuchowski et al. 1977b; Davis et al. 1981a; Abuchowski et al. 1984; Davis et al. 1991). En 1990, la adenosina desaminasa bovina (ADA) modificada con PEG de Mr 5000 (PEG-ADA, ADAGEN®, producida por Enzon, Inc.) se convirtió en la primer proteína PEGilada en ser aprobada por la Administración de Fármacos y Alimentos de Estados Unidos, para el tratamiento de la enfermedad de deficiencia inmune combinada grave debido a la deficiencia de ADA (Hershfield et al. 1987). La experiencia en los pasados 12 años ha demostrado que los anticuerpos anti-ADA pueden detectarse mediante ELISA sensible en la mayoría de los pacientes durante el tratamiento crónico con PEG-ADA, pero no ha habido ninguna reacción de hipersensibilidad o alérgica; se ha producido la depuración acelerada de PEG ADA en unos pocos pacientes productores de anticuerpos anti-ADA, pero este usualmente ha sido un efecto transitorio (Chaffee et al. 1992; Hershfield 1997). Debe apreciarse que la función inmune de los pacientes con deficiencia de ADA usualmente no se vuelve normal durante el tratamiento con PEG-ADA (Hershfield 1995; Hershfield y Mitchell 1995). De ese modo, la inmunogenicidad podría ser un problema más significativo en el desarrollo de una enzima PEGilada para el tratamiento crónico de pacientes con función inmune normal.

La inmunogenicidad será entendida por aquel con experiencia común como relacionada con la inducción de una respuesta inmune mediante la preparación inyectada de un antígeno (tal como proteína modificada por PEG o proteína...

1. Proteína que comprende una proteína uricasa recombinante de una especie de mamífero que ha sido modificada para insertar uno o más residuos de lisina, en la que dicha proteína recombinante es una proteína quimérica de dos o más secuencias de aminoácidos de proteínas de mamífero.

2. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha proteína uricasa recombinante comprende 304 aminoácidos, siendo la primera parte N-terminal de 225 de dichos 304 aminoácidos, los aminoácidos 1-225 de uricasa porcina y siendo los 79 aminoácidos restantes de dichos 304 aminoácidos, los aminoácidos 226-304 de uricasa de mandril.

3. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha proteína uricasa recombinante comprende 304 aminoácidos, siendo la primer parte N-terminal de 288 de dichos 304 aminoácidos, los aminoácidos 1-288 de uricasa porcina y siendo los 16 aminoácidos restantes de dichos 304 aminoácidos, los aminoácidos 289-304 de uricasa de mandril.

4. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína uricasa recombinante se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 2, 4, 8, 9, 10 y 11.

5. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que ha sido modificada para insertar entre dos y ocho residuos de lisina.

6. Molécula de ácido nucleico aislada y purificada que codifica la uricasa recombinante según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. Molécula de ácido nucleico aislada y purificada según la reivindicación 6 que posee la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.

8. Molécula de ácido nucleico aislada y purificada según la reivindicación 6 que posee la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3.

9. Vector que comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

10. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 9.

11. Conjugado de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un poli(etilenglicol) o poli(óxido de etileno).