Procedimiento de inmunoensayo.

Un procedimiento para llevar a cabo inmunoensayos asistidos por vacío sobre una o más membranas quecomprende las etapas de:

a) proporcionar un colector de vacío, un medio portador (2) para una membrana de transferencia formado porun soporte poroso (4) que soporta una o más capa de membrana de transferencia y un distribuidor de flujo (10)para proporcionar una distribución de líquido regular sobre dichas una o más capas de membrana detransferencia, que mantienen juntos, conteniendo dichas una o más membranas una o más entidades biológicasa ensayar, estando un regulador de flujo sobre la parte superior de la membrana y uno o más pocillos (12)colocados sobre la parte superior de la parte de distribuidor de flujo del medio portador;

b) añadir uno o más reactivos al uno o más pocillos y aplicar un vacío para extraer los reactivos en lamembrana, y

c) añadir uno o más agentes de lavado al uno o más pocillos y aplicar un vacío para extraer los agentes delavado y cualquier reactivo no-unido a través del distribuidor de flujo, la membrana y el soporte poroso y dentrodel colector de vacío, y

d) repetir las etapas b) y c) una o más veces adicionales.

Procedimiento de inmunoensayo La invención se refiere a un dispositivo y un procedimiento para la detección y la colocación de sustancias que estáncontenidas en una membrana de transferencia. Más particularmente, se refiere a una técnica para aplicar reactivos y soluciones de lavado a una membrana de transferencia para llevar a cabo rápidamente esta detección mediante eluso de vacío o presión positiva.

La presente invención es como se reivindica en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención La utilización de gel de electrofóresis es actualmente la técnica omnipresente para la separación de materialesbiológicos. Los materiales no biológicos también se pueden separar usando geles u otros soportes cromatográficos, pero el alcance del esfuerzo respecto de los productos biológicos es mayor. Las aplicaciones típicas incluyen laseparación de fragmentos de ácido nucleico de diversas dimensiones, bien en el contexto de la determinación desecuencia, en la detección de polimorfismo, o bien en la verificación de dimensiones en otros contextos. También sellevan a acabo frecuentemente separaciones de proteínas, glicoproteínas, fragmentos de proteínas y la aplicación deseparaciones de gel como verificación de la homogeneidad o la pureza, la identificación de modificaciones de posttraducción y la confirmación del peso molecular.

En todos estos procedimientos, las muestras mezcladas de entidades biológicas se aplican a geles electroforéticos y los componentes se separan por la aplicación de un campo eléctrico a través del gel. Con independencia de lamanera en que se desarrolla el gel, se debe detectar de alguna manera el modelo resultante de migración de lassustancias contenidas en la muestra.

Para llevar a cabo esta detección, típicamente el soporte de gel se pone en contacto con una membrana detransferencia, a la cual se han transferido las sustancias en el mismo modelo en el que aparecen sobre el gel. Sedetectan entonces los “puntos”, a un nivel mínimo, bloqueando la membrana con una proteína o una solucióndetergente para reducir la unión no-específica (que de otro modo conduce a un nivel elevado de ruido y un nivel bajode detección) . Los agentes de bloqueo típicos incluyen (generalmente aproximadamente el 1-5%) en solución salinacon tampón tris con tensioactivo TWEEN® (solución TBS-T) o solución salina con tampón fosfato con tensioactivoTWEEN® (solución PBS-T) . La entidad biológica se incuba entonces con un anticuerpo específico para el antígenosobre la membrana. La membrana se lava entonces exhaustivamente para eliminar cualesquiera contaminantes, proteínas de bloqueo no unidas o anticuerpos no-unidos y similares. Entonces la membrana se trata e incuba con unanticuerpo secundario conjugado con enzima, radioisótopo, flúorflúor o biotina específico para el anticuerpo primario.A continuación la membrana se vuelve a lavar exhaustivamente para eliminar cualquier anticuerpo secundario nounido. A continuación, se aplica un reactivo de detección, generalmente un material cromogénico, quimioluminiscente, fluorescente, radiológico o marcado con estreptavidina, lo cual se une a, o es un sustrato delconjugado de enzima. Finalmente, el dispositivo de detección apropiado se usa para determinar la presencia, ausencia, posición, cantidad, etc. de la entidad biológica. Las últimas seis etapas llevan generalmente de 3 a 6 horasa una noche dependiendo de la velocidad de la reacción entre los reactivos seleccionados, la membrana y la entidadbiológica. El procedimiento requiere múltiples periodos de incubación de la membrana sobre una plataformaoscilante u otra plataforma de mezclado apropiada. Es un procedimiento largo que no gusta a la mayoría de losinvestigadores y que consume (gasta) un gran volumen de reactivos.

Algunos investigadores han sugerido el uso de la acción capilar de un material absorbente, tal como un filtro de papel, colocado por debajo de la membrana para extraer los fluidos restantes a través de la membrana y mejorar la velocidad del procedimiento, especialmente las etapas de lavado.

El documento US 5.155.049 menciona un sistema denominado cámara de hibridación Hybrid-EaseTM comercializado por Hoefer Scientific Instruments. Esta cámara está constituida por dos rejillas entre las cuales está cogida en sándwich la membrana. Las placas de rejilla se colocan en posición rodeando la membrana, y las jeringas semontan dentro del espacio creado por las rejillas. Se usa una jeringa para aplicar reactivos y lavar, y la otra pararetirar el sobrante. El sistema requiere grandes volúmenes de líquido para funcionar, es incómodo de emplear y sigue consumiendo demasiado tiempo. También menciona que en algunos ensayos particulares, tales como ensayos ELISA, en pocillos de pequeño volumen (tales como placas de microtitulación 96) , otros han usado vacío para extraer líquidos a través de una membrana en una etapa de lavado. Sin embargo descartan esta etapa, ya quesolamente está disponible en aplicaciones de pequeño volumen y sigue siendo incontrolable. Sugieren en su lugar que el mejor procedimiento es usar una prensa manual que tiene la membrana en la parte superior de un filtro depapel y una capa de cobertura y a continuación prensar el emparedado de membrana entre dos placas para exprimir el líquido a través de la membrana y dentro del papel.

En el documento USSN 60/732.994, presentado al 3 de noviembre de 2005, se sugiere el uso de un dispositivoformado por diversas capas que incluyen una capa de soporte porosa por debajo de una o más capas de membranade transferencia, un distribuidor de flujo por encima de la (s) membrana (s) de transferencia y un pocillo sobre eldistribuidor de flujo para contener el líquido en el área deseada y permitir menores volúmenes de partida de tallíquido. Preferiblemente, el distribuidor de fluido es una membrana porosa de no-unión o de baja unión, tal como unamembrana de 0, 22 micrómetros. Las capas del dispositivo se ensamblan en orden y a continuación se someten avacío o una filtración por presión para lavar y detectar las entidades biológicas sobre la membrana.

Es evidente que se requiere un procedimiento más eficaz para la detección de los materiales o entidades biológicassobre membranas de transferencia. La presente invención permite una detección más efectiva y más eficaz deentidades biológicas en una membrana de transferencia.

El documento EP 0 312 394 describe inmunoensayos con soporte de membranas, que tienen una membrana y usanuna submembrana y un prefiltro por debajo de la membrana.

Sumario de la invención En una realización, la invención se refiere a un aparato útil para la realización del procedimiento de la invención. Eldispositivo está constituido por un medio portador de membrana de transferencia formado por una capa de soporteporoso inferior y un distribuidor de flujo superior. Ambos se mantienen juntos mediante un procedimiento tal comopor bisagra, pinzas, cintas elásticas, adhesivos, rótulas, husillos y recesos, o dispositivos de fijación cooperativa uotros medios de este tipo. El medio portador se abre y una o más membranas de transferencia se colocan entre lascapas inferior y superior. El medio portador se sella entonces y se coloca bien sobre un colector o dentro de unaparato especial (descrito más adelante) para procesar las muestras sobre la membrana de transferencia. En unarealización, el distribuidor de flujo tiene un perímetro exterior que se extiende hacia arriba desde el distribuidor deflujo para formar un pocillo para contener reactivos y fluidos de lavado.

En otra realización, el pocillo y el distribuidor de flujo están subdivididos en dos o más subpocillos para discurrir enparalelo a las membranas de transferencia o subpartes de una membrana de transferencia, cada membrana seprocesa típicamente con al menos un reactivo diferente.

En otra realización, el distribuidor de flujo es una membrana porosa de no-unión o baja unión, tal como una membrana de 0, 22 micrómetros.

En otra realización, una capa plegable porosa, tal como un filtro de papel o papel de vidrio, se coloca por debajo dela membrana de transferencia y por encima del soporte poroso para que, de este modo, cuando la membrana deldistribuidor de flujo se fija contra la membrana de transferencia, la capa plegable se deforme para garantizar un acoplamiento completo y un flujo uniforme entre la membrana de transferencia y el distribuidor de flujo.

En otra realización, el medio portador tiene una pared solidaria formada por encima por encima del distribuidor de flujo para contener reactivos y/o fluidos de lavado durante el procesamiento de los mismos.

Otras realizaciones incluyen un colector de presión o de vacío destinado a retener el soporte... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para llevar a cabo inmunoensayos asistidos por vacío sobre una o más membranas que comprende las etapas de:

a) proporcionar un colector de vacío, un medio portador (2) para una membrana de transferencia formado porun soporte poroso (4) que soporta una o más capa de membrana de transferencia y un distribuidor de flujo (10) para proporcionar una distribución de líquido regular sobre dichas una o más capas de membrana de transferencia, que mantienen juntos, conteniendo dichas una o más membranas una o más entidades biológicasa ensayar, estando un regulador de flujo sobre la parte superior de la membrana y uno o más pocillos (12) colocados sobre la parte superior de la parte de distribuidor de flujo del medio portador;

b) añadir uno o más reactivos al uno o más pocillos y aplicar un vacío para extraer los reactivos en lamembrana, y

c) añadir uno o más agentes de lavado al uno o más pocillos y aplicar un vacío para extraer los agentes delavado y cualquier reactivo no-unido a través del distribuidor de flujo, la membrana y el soporte poroso y dentrodel colector de vacío, y

d) repetir las etapas b) y c) una o más veces adicionales.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que las etapas b) y c) se repiten de 2 a 5 veces.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que vacío está entre 133 milibares y 1.013 milibares.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que i) el medio portador tiene un medio (16) para asegurar de forma desprendible el soporte y el distribuidor entresí seleccionado, por ejemplo, del grupo que consiste en bisagras, pinzas, cintas elásticas, adhesivos, rótulas, husillos y recesos, o dispositivos de fijación cooperativa, o ii) el distribuidor de flujo tiene una superficie inferior y una superficie superior y la superficie superior tiene unoo más pocillos montados sobre la superficie superior del distribuidor de flujo, o iii) el distribuidor de flujo tiene una superficie inferior y una superficie superior y la superficie superior (14) tieneuno o más pocillos montados sobre la superficie superior del distribuidor de flujo, en el que el o los pocillos sonuna parte formada solidariamente de la superficie superior del distribuidor de flujo, o iv) el distribuidor de flujo tiene una superficie inferior y una superficie superior (14) y la superficie superior tieneuno o más pocillos montados sobre la superficie superior del distribuidor de flujo, en el que el o los pocillos sonuna parte formada solidariamente de la superficie superior del distribuidor de flujo, o v) el medio portador está fabricado en un material seleccionado entre el grupo que consiste en plástico, papel, metal, cerámica y las combinaciones de los mismos, o vi) el distribuidor de flujo es una membrana, o vii) el distribuidor de flujo tiene una superficie inferior y una superficie superior y la superficie superior (14) tieneun pocillo montado sobre la superficie superior del distribuidor de flujo, o viii) el medio portador tiene más de un distribuidor de flujo y cada distribuidor de flujo tiene una superficie inferior y una superficie superior y tiene un pocillo montado sobre la superficie superior de cada uno de entre uno o másdistribuidores de flujo.

5. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que una bandeja de recogida (22) está provista por debajo del medio portador para la recuperación de reactivos, y opcionalmente en el que la bandeja está subdividida en dos

o más sub-bandejas separadas.